Các nhà sinh hóa chia enzyme cắt giới hạn nói chung thành ba loại, gọi là Loại I, Loại II và Loại III. Đối với hai loại I và III, cả hoạt tính phân giải acid nucleic hay phân giải nhóm methyl đều thực hiện chung bởi một phức hợp enzyme lớn. Mặc dù những enzyme thuộc hai loại này cũng nhận biết những trình tự DNA đặc hiệu, vị trí cắt thường cách xa vị trí nhận biết, có khi đến cả trăm base. Chúng cũng cần ATP để hoạt động. Những enzyme này bắt đầu bằng việc kiểm tra tình trạng methyl hóa của 2 adenine trong vùng nhận biết. Nếu cả hai adenine đều không được methyl hóa (dấu hiện cho thấy đây là DNA ngoại lai), phức hợp enzyme thay đổi cấu hình và thực hiện hoạt tính phân giải. Tuy nhiên, nếu một trong hai adenine được methyl hóa, chứng tỏ là DNA của tế bào, enzyme khi đó sẽ thực hiện chức năng của một enzyme methyl hóa cho gốc adenine còn lại để duy trì sự ổn định cho DNA bộ gene.Với enzyme giới hạn loại II, chức năng phân giải của nó không liên quan đến chức năng methyl hóa hay phân giải nhóm methyl, và vị trí cắt cũng nằm ngay bên trong hay kế cạnh vị trí nhận biết. Ngày nay người ta biết rất nhiều enzyme khác nhau loại này và chúng là một trong những công cụ sinh học phân tử thiết yếu, đặc biệt thường gặp trong các ứng dụng dòng hóa gene hay phân tích DNA.